Peces, xenes e chips: liberdade de expresión ante a contaminación
(Foto: Laboratorio de Peixe Cebra de ZFIN e Oregón)
A medida que aumenta a contaminación, cada vez é maior a necesidade de coñecer cales son os danos que estes contaminantes provocan nos organismos, como condicionan o comportamento do organismo e como poden preverse estes efectos. Paira o estudo destes danos, aínda que os estudos centráronse en varios niveis, os realizados a nivel molecular materializáronse, promovido e feito imprescindible ao coñecer toda a secuencia xenómica dos seres eucariotas (mosca de froita, lombriga de terra ou ser humano).
A razón desta importancia radica na función e características do propio xenoma, que pode ser considerado como una biblioteca que alberga toda a información (fenotipo) paira formar cada organismo. Esta biblioteca está organizada en libros ou xenes que almacenan información paira producir proteínas que cumpren a maioría das funcións da célula. Así, os cambios nos xenes e/ou na expresión destes xenes poden provocar alteracións no funcionamento normal da célula.
Regulación da expresión génica
As diferenzas fenotípicas entre especies (arquitectura corporal, metabolismo, comportamento...) deben entenderse nun dobre nivel. Por unha banda, cada especie ten a súa propia biblioteca (xenoma); algunhas especies están dotadas de numerosos libros (xenes) e outras menos. Doutra banda, e como acabamos de coñecer, os xenomas do home e do mono están dotados de forma similar, polo que outra cousa debe condicionar as diferenzas notables entre estas dúas especies. Nesta segunda variable participa a regulación da expresión génica.
En gran medida, os libros que temos na biblioteca lémolos dunha ou outra maneira. Iso queda claro si miramos noso colco. Os seres humanos somos seres pluricelulares e, aínda que todas as nosas células teñen o mesmo xenoma, é difícil marcar as semellanzas entre un hepatocito e una neurona, xa que as células durante o desenvolvemento, segundo as condicións do medio, expresan (len) determinados xenes (libros). Por iso, paira gañar na competición entre especies utilizamos as vías metabólicas de cada momento, sempre co obxectivo de obter o máximo rendemento enerxético.
Por exemplo, os habitantes do primeiro mundo facemos tres comidas ao día. Por tanto, paira cumprir coas nosas obrigacións enerxéticas, por unha banda recorremos ao metabolismo dos hidratos de carbono a través das encimas da glicolisis, pero doutra banda acumulamos lípidos a través da produción de triglicéridos. Por iso, non necesitamos o catabolismo dos lípidos ata que sentimos fame. Cando se inicia una folga de fame, por exemplo, os xenes produtores de encimas procedentes das vías metabólicas que interveñen no catabolismo dos triglicéridos comezan a expresarse rapidamente. É o que se coñece como regulación da expresión génica.
Paira levar a cabo esta regulación, os seres pluricelulares están dotados de proteínas especiais, factores de transcrición, que traballan na exploración continua do medio celular. A función destas proteínas é facer fronte aos cambios que se producen no medio (cambios na concentración dos alimentos, factores fisiológicos, hormonas, parásitos, enfermidades...) mediante cambios na expresión génica.
Todos os compostos contaminantes e tóxicos presentes no medio son, por tanto, una variable ambiental paira estes factores de transcrición. Poremos un exemplo: na maioría dos animais pódense distinguir exemplares masculinos e femias. As principais diferenzas entre machos e femias dependen de dúas hormonas na maioría das especies: a testosterona nos machos e o estradiol nas femias. O estradiol pon en marcha alternativas de desenvolvemento representativas nas femias mediante un factor de transcrición denominado receptor de estrógenos. Isto provoca a produción de vitelogenina, a lipoproteína de reserva máis importante dos ovocitos das peces femias (tamén noutros grupos). Producen peces femias, non machos, aínda que tamén teñen o xene que produce vitelogenina.
En grandes cantidades chegan aos nosos ríos compostos cunha estrutura química similar ao estradiol, como os alquilfenoles de xabóns utilizados nas nosas limpezas, os ftalatos utilizados en plásticos ou as hormonas artificiais que tomamos nas pastillas anticonceptivas.
Estes compostos transcriben a través do receptor de estrógenos o xene que codifica a vitelogenina nos machos. Pero o xene da vitelogenina non é o único que responde; os compostos estrogénicos dados a un macho inflúen na expresión de centos de xenes. En consecuencia, existen no mundo fluvial, onde os peixes machos producen proteínas marcadoras das femias, nas que xunto cos espermatozoides tamén se atoparon ovocitos nalgúns casos. Este exemplo pon de manifesto, por tanto, os efectos significativos que sobre as poboacións de moitos organismos poden ter algúns compostos de uso cotián.
Toxicoloxía e xenómica xuntos
Uno dos obxectivos actuais sería, por tanto, coñecer as obrigacións de todos estes xenes de diferentes xenomas na célula. Aínda que aínda estamos bastante lonxe, ano tras ano coñecemos o xenoma de máis organismos e coñecemos cada vez máis claramente cales son os mecanismos de regulación da expresión génica. Por tanto, a toxicogenómica ten como obxectivo investigar que mecanismos de regulación da expresión génica pon en marcha certos contaminantes.
Sábese que non todos os individuos expostos a contaminantes ambientais responden da mesma maneira. Esta resposta está limitada por factores internos do propio hóspede (estado de desenvolvemento, carácter xenético, hormonal, metabólico...) e ambientais (concentración do contaminante e tempos de exposición). Por tanto, en función da combinación entre contaminante, presenza de cofactores e sensibilidade xenética, dous individuos ou dúas células do mesmo individuo poden dar resposta diferente a un efecto determinado.
A resposta dos organismos ante unha determinada sustancia tóxica é consecuencia das interaccións da expresión de diferentes xenes. Por iso, nos últimos anos cada vez son máis os laboratorios que están a estudar estes xenes. De aí naceu a toxicogenómica.
En toxicogenómica, a análise da expresión génica, ademais de informar o estado das células, móstranos como responden estas células ante diferentes estímulos. Por tanto, en primeiro lugar, deberiamos coñecer a secuencia xenómica do organismo de interese ou, polo menos, os abafos nos que as variables do medio poden expresarse en exceso ou en exceso e en que vías metabólicas interveñen.
Nos últimos anos avanzouse enormemente neste campo e é coñecido en gran medida polos diferentes tipos de compostos, como os que provocan a inflamación, os compostos estrogénicos, os inmunosupresores ou os carcinogénicos, que modifican a expresión dos xenes. Así, por exemplo, cando falamos de estrogenicidad, sabemos que os principais xenes a analizar son os que codifican a vitelogenina (nos peixes) e as proteínas da matriz extracelular do ovo; cando falamos de inmunosupresores, a interleucina, a proteína do complemento ou varios tipos de citoquinas; e cando falamos de carcinogénicos, xunto cos xenios Bcl-2, p53, c-myc, etc.
Á hora de determinar cales son os xenes a estudar, o traballo dos futuros toxicolóxicos sería investigar os cambios expresivos destes xenes fronte aos contaminantes. Con todo, en casos descoñecidos, os toxicólogos deberían buscar novos xenes que respondan os efectos do contaminante.
Uso de peixes en toxicogenómica ambiental
Dicir que os peixes son os mellores organismos á hora de analizar a toxicoloxía ambiental non é dicir demasiado, xa que estes vertebrados teñen o corpo mergullado na auga e, por tanto, están directamente relacionados cos contaminantes presentes no medio, xa sexa a través das branquias ou do sistema intestinal hepático. O grupo de peixes é un grupo amplo, tanto no número de especies como no número de individuos dentro da especie, o que a converte nun grupo de organismos con diferentes fisiologías, formas de vida e diversos sistemas de adaptación.
Esta diversidade tamén se reflicte no xenoma, xa que os peixes presentan un xenoma moito máis plástico e cambiante que outros vertebrados. Por tanto, ante os cambios que se producen no medio, a contaminación, especialmente o peixe, é máis sensible que outros moitos organismos. Así mesmo, a utilización do peixe como modelo levaranos a comprender mellor o xenoma dos mamíferos á hora de interpretar os xenomas doutros taxones. Ademais, non hai que esquecer que moitas especies de peixes, ademais da súa importancia ecolóxica ou científica, teñen tamén una importancia económica, especialmente naqueles países nos que o peixe é un alimento habitual.
Así, actualmente trabállase con numerosas especies de peixes, entre elas o peixe cebra, a medaca, a carpa, a troita, o salmón e a platija. Aínda que o noso coñecemento do xenoma duns e outros é radicalmente distinto, na actualidade (novembro de 2005) coñecemos máis de 10.000 secuencias de xenes que se expresan en 14 especies de peixes teleósteo. Ademais, a secuencia completa do xenoma dos teleosteos Fgu rubripes , Danio rerio e Tetraodon nigroviridis xa é coñecida.
Microchips: ferramentas paira investigar a expresión génica
Temos peces e xenes que queremos estudar, que facer con eles? Cal é a metodoloxía a seguir? Os microbildumas de ADN ou microchips son ferramentas de traballo actuais e futuras baseadas na análise holístico da expresión génica, cada vez máis coñecidas. Estes chips están formados por centos ou miles de sondas de ADN correspondentes a xenes de interese unidos nun soporte sólido.
Os microchips teñen só o tamaño de pórtalas de vidro que se utilizan no microscopio e permítennos detectar simultaneamente todas as secuencias que nos interesan e son coñecidas. Con eles pódense detectar moléculas adicionais de ADN e ARN marcadas con diferentes marcadores. Paira iso, extráese o ARN de cada un dos órganos dos peixes (como o fígado) tratados con contaminantes e non tratados, e sintetízase, mediante transcrición inversa, o ADN auxiliar (cDNA). Este cADN constitúe a transcriptoma da célula, é dicir, a recompilación da expresión génica do xenoma dese animal nese momento. Este cDNA pódese marcar con marcadores fluorescentes, uno en verde e outro en vermello, en definitiva, co obxectivo de diferenciar o material xenético de ambos os organismos. A continuación combínanse as mesmas cantidades de cDNA dos organismos que queremos analizar e comparar e se hibrida a mestura con microchip. Así, si no momento da extracción no peixe tratado estaba a expresarse moita vitelogenina e no momento da extracción no que non se trataba, poderíase detectar esta diferenza polas diferentes cores que o chip vai presentar paira ese xene.
Nos experimentos de laboratorio que se levaron a cabo ao longo do mundo, determinados tipos de peces mantivéronse expostos a certos compostos tóxicos. Nestes casos desenvolvéronse microchips sobre algún dos órganos do peixe, polo que xa se coñece o xene que responde á exposición destas especies a este tipo de contaminantes.
Estes patróns de expresión non difiren moito dos coñecidos nos mamíferos. Na actualidade, se algún destes organismos que coñecemos como cambia o patrón de expresión dos xenes atópase baixo a influencia dun composto descoñecido no medio, teriamos a capacidade de identificar o tipo de contaminante respecto dos patróns de expresión que coñecemos. Desta forma, antes de que este contaminante poida causar danos aos seres vivos, teriamos a oportunidade de tomar medidas locais paira evitalos. Da mesma maneira, una vez fabricadas novas drogas e compostos, podemos prever os cambios que estes poidan producir aos organismos antes da súa posta no mercado.
Mecanismos moleculares de contaminantes e análises da calidade ambiental
Nos últimos anos os laboratorios que aplican chips aos peixes son cada vez máis numerosos, tanto en experimentos de laboratorio como en poboacións rurais. Nos estudos que se están realizando no Reino Unido, por exemplo, está a tratarse de determinar novos biomarcadores moleculares que respondan a contaminantes específicos e definir cales son os seus mecanismos.
Así, comparáronse as expresións génicas dos peixes platija que habitan na árida ría chamada Alde e na contaminada ría de Tyne. Paira iso, tras clonar na platija xenes relacionados con diferentes tipos de tensións noutras especies, deseñaron un microchip de 13.000 secuencias. Tras hibridar o cDNA dos peixes de ambas as zonas con chipis, atopáronse diferenzas expresivas significativas en cen secuencias. Os máis representativos dos que aparecen inducidos en Tyn relacionáronse coa presenza de altas concentracións de hidrocarburos policíclicos aromáticos no medio CYP1A1, paraoxonasa, (encimas da fase I do metabolismo de detoxificación), UDPGT e aldehído deshidrogenasa (encimas da fase II). Os cambios atopados no resto de xenes, con todo, responden á tensión global.
Ademais, observaron que no estradiol indúcense, entre outros, os xenes que codifican a vitelogenina e a coriogenina. Algúns destes cambios expresivos describíronse noutros experimentos de laboratorio recentes. Por exemplo, nos machos de platija mantidos durante 21 días baixo o estradiol de etinil, máis de 200 xenes manifestaron diferente expresión en animais tratados. Cabe destacar que entre estes xenes atópase inducida a expresión do xene que codifica a vitelogenina, a UDPGT e a proteína da matriz extracelular de ovocitos, ZTP.
Por tanto, os microchips de ADN son potentes ferramentas paira caracterizar as propiedades toxicolóxicas das sustancias químicas. Como calquera outra técnica en crecemento, aínda son necesarias numerosas investigacións paira poder definir e considerar o uso de microchips de ADN no campo/contorna desde o punto de vista da ecotoxicología. Con todo, os microchips son fotografías exactas da expresión génica dos organismos e poden mostrar claramente como a fisiología do peixe reorganízase baixo os efectos dos cambios no medio do peixe.
BIBLIOGRAFÍAZu idazle
Zientzia aldizkaria
