Zelula Txikien Misterio Handiak Eta nola Adierazle Fluoreszenteak argibide bihurtu diren
Azken belaunaldian egin diren aurkikuntzek munduari buelta eta erdi eman diote. Alde batetik, espaziorantz bideratutako ikerketek lurraz kanpora eta beste planetetara eraman gaituzte. Unibertsoan beste bizi-motak izan direla edo ba ote daudeneko ideia inoiz baino indartsuago agertzen zaigu gaur egun. Bestalde, barrurako bidaia atomoaren barne-partikulen egiturari buruzko lanak sakondu ditu eta horiek ere unibertsoari buruzko asmo berriak plazarazi dituzte. Oraindik, ordea, ugariago dira erantzun gabe dauden galderak erantzundakoak baino.
Zelula bizia gure planetako egiturarik konplexuena eta harrigarriena da dudarik gabe. Batetik, barruan duen informazio aberatsa eta egitura trinkoagatik (pentsa dezagun, adibidez, balea bat sortzeko garapen-programa DNA nanogramo gutxitan gordetzen dela). Bestetik, zelula bakoitzak lan konplexua betetzen du oso leku txikian. Une oro, izan ere, milaka molekula desberdin makina bat erreakzio biokimiko burutzen ari dira plan metaboliko zehatz eta katramilatsu baten barruan. Aldi berean, zelularen egiturari eusten diote eta gainera, organismo osoaren zelulez osatutako unibertsoan beren eginkizuna zuzen betetzen dute (mundu osoko biztanle-kopurua baino handiagoa da gure gorputzeko odolaren zelula-kopurua). Halako erakustaldiaren aurrean, gizakiak egindako makinarik ikusgarriena ere jostailu traketsa besterik ez dela pentsa dezakegu.
Zelularen barruan gertatzen diren fenomeno gehienak oraingoz misterioak dira. Dena den, aurrerapen batzuk lortu dira eta ikerketarako bidea zabalik dago.
Orain dela urte gutxira arte, erreakzioak banaka edo taldeka aztertzen ziren kristalezko hoditan zelulak desegin ondoren. Estrategia honek aurrerapen handiak ekarri ditu. Besteak beste, zelulen konposatu askoren egitura eta jatorria, sorbidea eta helburua ezagutzea lortu da. Horren bidez; glikolisia, Krebs-zikloa eta bestelako prozesu metaboliko nagusiak argitu egin dira. Ikerketa honek, ordea zelularen arkitekturaz kanpoegin direnez, beste zehaztasun asko ilunpean gelditu dira, besteak beste zelularen barruan gertatzen diren prozesuen benetako abiadura, kokapena eta norabide espaziala. Adibidez, garunaren barruan neuronen arteko erlazioez ez da datu zehatzik eskuratu, oso espazio txikian erreakzio asko eta konplexuak gertatzen direlako.
Lehen aipatutako oztopoak gainditzeko asmoz, zientzilariak teknika berriak garatzen ahalegindu dira biziaren prozesu horiek zelularen osotasunari eutsiz aztertu ahal izateko. Teknika berri horien oinarria espektroskopia da. Hau da, zelula oso bat uhin elektromagnetikoez irradiatu ondoren, zelula zeharkatuz edo islapenaz jasotako uhinek zelulari buruzko egituraren informazioa gordetzen dute. Horretan datza, hain zuzen ere, erradiografietan erabiltzen den teknika. Hezurrek oztopatzen dituzten X izpiak ez dira pelikulara iristen eta horri esker, hezurraren formari buruzko informazioa lortzen dugu.
Zelularen barruko arkitektura molekularra oso konplexua den arren, molekula-mota gutxiz osatua da. Adibidez, bakterio baten proteina guztiak (3.000 bat) 20 bat aminoazido desberdinen konbinazioez osatuta daude. Hona hemen bizitzaren trebetasun liluragarria. Eta horixe bera gertatzen da lipido eta karbohidratoen artean. Misterioa konbinaketan dago!
Beraz, eta zoritxarrez, uhin elektromagnetikoen aurrean proteina guziak antzekoak agertzen dira eta, ondorioz, proteina bakoitzaren lana banaka aztertzea ezinezkoa da. Ez da hori, gainera, arazo bakarra: batetik, erabilitako erradiazioaren intentsitateak eta uhin-luzerak (energia) zelulari kalterik eragiten ez dioten mugen barruan egon behar dute. Bestetik, zelulak urez osatuta daude neurri handi batean eta uhin-mota asko ezin daitezke erabili urarekin interferentzia sortzen dutelako.
Zelularen ikerketak arazo askori egin behar izan badio aurre, antzeko zerbait gertatu da kanpo-espazioa ikertu nahi izan denean; kasu askotan, zundak erabili dira. Bestela esanda, makina aproposak egin eta, gero, espaziora bidali dira ikertu nahi den parametroa neurtzeko. Neurketaren seinalea irrati-bidez jasotzen dugu Lurrean ondoren.
Zelulen barruko lanetan, lehen aipatutako arazoen aurrean ere, molekula adierazleak (edo zundak) sortu dira. Zunda molekularrak zunda espazialak egiten duen lan bera zelularen barruan egiteko gai izan behar du. Funtsean, hauek dira zunda-mota honen ezaugarri nagusiak:
- Zelularen barruan dauden molekula guztietatik seinale espektroskopikoa (uhinen aurreko erantzuna) zeharo desberdina eta guztiz bereizitua izatea.
- Erreakzio edo molekula baten adierazle zehatza izan behar du, ikertzaileak fenomenoak banaka ikertu ahal izateko.
- Zelularen barrurako bidaia zelula nekarazi gabe egin behar da. Gainera, zelularen barruan kokaleku zehatza eta jakina eduki behar du zundak: nukleoan, zitoplasman, mitokondrioan eta abarretan.
- Zelularen barne-egitura eta funtzioa normalak izan behar dute neurketa egiten den une.
Ezaugarri hauek guztiak biltzen dituen zunda ez da sortzen erraza, jakina; espaziora bidaltzen ditugun makinen ezaugarri guzti-guztiak molekula baten barruan sartu behar dira. Zorionez, kimikari organikoen eta biokimikarien arteko elkarlanak emaitza ikusgarriak ekarri dizkigu arlo honetan ere. Fluoreszentzia izan da beraien tresnarik lagungarriena.
Zer da fluoreszentzia?
Molekula batzuek azaltzen duten fenomeno bitxia da eta oso baliagarria suertatu da. Argia uhinez osatuta dagoenez, molekula guztiek uhin-luzera jakin bateko argia zurgatzen dute; gainerako uhinak zeharkatzen dituzte edota bueltan islatu egiten dira. Dakigunez, klorofila berdea da; adibidetzat hartzen badugu, ikusiko dugu argi zuriaz irradiatuz gero argi urdina (uhin-luzera 390 eta 500 nm artekoa dena) eta gorria (uhin luzera 650 eta 780 nm artekoa dena) zurgatzen duela eta besteak bueltan islatuak ikusten direla. Islatutako argiaren kolorea bi espektroren arteko diferentzia da: irradiatutako argi zuriaren eta zurgatutakoaren arteko diferentzia, hain zuzen: argi berdea (500 eta 650 nm artekoa). Beraz, kolorea duten gauza guztiek argi zuriari zerbait kentzen diote. Zuriek ezer ez. Beltzek, aldiz, den-dena. (Ikus 1. irudia).
Zer gertatzen da, ordea, zurgatutako argi-uhinekin? Argiaren uhinak, edozein uhinek bezala, energia transmititzen dute eta uhinak zurgatzen dituen molekulak egoera kitzikatura pasatzen dira jasotako energiaren ondorioz. Berriro bere energi egoera normalera itzul dadin, energia hori beste modu batez igortzen du. Kasu askotan energia baxuko uhinez osatuta dagoen beroa da igorritako energia hori. Kasu berezietan, ordea, zurgatutako kitzikatze-energia beste uhin ikusgarri baten bidez igortzen da eta igortzen den argiaren energia zurgatutako argia baino energia gutxiagokoa da beti. Beste modu batera esanda, beste kolore bateko argia kanporatzen du kitzikatutako molekulak. Eta horixe da, hain zuzen ere, fluoreszentzia.
Diskoteketan maiz erabiltzen diren argi beltzek guk ikusterik ez dugun energia altuko uhinak kanporatzen ditu. Baina, uhin horiek zenbait molekula kitzikatzeko ahalmena dituzte. Kitzikatutako molekula horiek, era berean, argi urdin-txurixka igortzen dute. Adibidez, alkandora txuriak, hortzak eta tonika berezko argia balute bezala agertzen dira (fluoreszentziaren eraginez).
Konposatu fluoreszente naturalak eta artifizialak ezagunak dira eta zelularen barruan gertatzen diren prozesuei buruzko informazio zehatza eman dezakete zunda bezala erabiltzen direnean.
Adierazle fluoreszenteak zelularen barruko pH-a neurtzeko erabili izan dira. SNARF eta fluoreszeina, protoiak (H+) lotzen dituzten taldeak, fluoreszentea den molekula batean ipini dituzte ikertzaileek. Molekula protoiz betetzen den neurrian, bere fluoreszentzi ezaugarriak aldatu egiten dira eta fenomeno hori neurgarria da.
Bestalde, protoiz betetzeko prozesua protoien kontzentrazioaren arabera gertatzen da. Beraz, irudian ikus daitekenez, protoien kontzentrazioa aldatzen bada, adierazlearen fluoreszentzi ezaugarriak ere aldatzen dira eta hori ere zehaztasun handiz neur daiteke.
Sistema aditu honen bidez zelularen barruko pH-a neurtzeko era horretako fluoroforo bereziak barruratu behar izan dira zelula nekarazi gabe. Sistema, ordea, ezin da edozein modutara lanean jarri. Gainditu beharko diren arazo tekniko batzuk gelditzen dira eta ez nolanahikoak, gainera. Protoiak lotzen dituzten taldeek karga elektrikoa dute eta urarekin elkarrekiten dute (hidrofiloak dira, beraz).
Bestalde, zelulak proteinaz eta lipidoz osatuta dagoen mintza zelularra du kanpoko ertzean, kanpo eta barruaren arteko molekula-trafikoa ondo kontrolatzen duena. Atezain molekular honek ez dio ezagutzen ez duen edozein molekula kargatuari barruratzen uzten eta adierazle fluoreszentea artifiziala denez, ez du barruratzeko aterik aurkitzen. (Ikus 2. irudia.)
Arazo honen aurrean, zientzilariek talde kargatuak mozorrotzea lortu dute esterifikazioaren bidez. Aldaketa kimiko honen bidez, molekula hidrofiloa izatetik hidrofoboa izatera pasatzea lortzen da; horren ondorioz, aurrean duen hesi lipidikoa erraz zeharka dezake, ate berezitik pasa gabe. Behin barruan, zelulak dituen esterasa entzimaren eraginez ester hidrofobikoak jatorrizko egitura berreskuratzen du eta fluoroforo aktiboak bere adierazle-lana egin dezake zelularen barruan.
Kasu batzuetan, adierazle fluoreszentea zitosolean gelditzen da, baina beste batzuetan zelularen barne-egituraren zati berezietan pilatzen da. Talde kimikoan aldaketa bakar batek eragin handia izan dezake molekularen zelula-kokalekuan. Adibidez, fluoreszeina zitoplasman gelditzen da, baina karboxifluoreszeina landare zeluletako bakuolan pilatzen da bereziki. Desberdintasun hauek zelula-zatien ikerketa bereziak egiteko erabili izan dira (ikus 3. irudia).
Zelularen pH-neurketek oso emaitza garrantzitsuak ekarri dituzte, baina adierazle fluoreszenteei ospe handiena ekarri dien lana zelularen barruko kaltzio(II)aren kontzentrazioaren neurketa da, dudarik gabe. Katioi sinple honek zelularen barne portaeran erantzukizun handia duela ikusi da azken urte hauetan egin diren ikerketei esker, bere egitekoa bigarren mezulariarena delarik.
Normalki, zelularen kaltzio(II)aren kontzentrazioa (zientzilarien hizkuntzan [Ca 2+ ]) zitoplasman oso baxua da (10-7 M ingurukoa) zelularen Ca 2+ gehiena konpartimendu berezietan pilatuta dagoelako. Animalietan erretikulu endoplasmatikoan eta landareetan bakuoletan pilatzen da bereziki.
Kanpotik seinale edo estimulu jakin batzuk jaso ondoren, konpartimentutan gordeta dagoen kaltzioa kanporatzen da eta zitoplasmaren kaltzio(II)a 10 -5 M-raino igotzera iristen da. Halako igoerak proteina berezietan eragin handia du eta erreakzio-kateak sorrarazten ditu. Erreakzio-katea hauen azken muturrean geneen espresioa dago. Beraz, zelularen barruan kaltzio(II)aren aldaketak neurtu ahal izatea oso garrantzitsua dela esan daiteke. Ca 2+ neurtzeko lehen adierazle fluoreszentea Roger Tsien-ek sortu zuen. EGTA, kaltzio-konplexatzaile ezagunetik abiatuz, BAPTA egitura berria sortu zuen.* Aldaketa honek BAPTAren ezaugarri espektralak aldatzen ditu. Zoritxarrez, ordea, BAPTAren zurgapen-espektroa zelulak dituen gainerako konposatuetatik hurbil dago eta horrek neurketarako arazoak dakartza. Horrexegatik, Tsien-ek beste talde fluoreszenteak ipini zituen BAPTAren izaera molekularra eta ezaugarriak mantenduz eta, horrela, Quin-2, Fura-2, Indo-1 eta azkenik Fluo-3 sortu zituen (ikus 4. irudia).
Gaur egun, zelularen [Ca 2+ ] bizi-bizian neur daiteke. Teknika hauen bidez argitu egin da zeluletako erantzun kimikoak oso azkarrak eta zehatzak direla (ikus 5. irudia).
Azken Iraultza: proteinak ikustea
Zelulen aktore esanguratsuenetakoak proteinak dira. Genetan kodifikatuta dagoen informazioa proteinetan adierazten da eta hauek dira bereiztasunak gauzatzen dituzten molekula langileak. Beraz, proteina desberdinak zelularen barruan lanean ikustea zientzilariek nekatu gabe jarraitu duten helburu nagusietako bat izan da. Injinerutza genetikoaren eta biokimikaren arteko elkarlanari esker, emaitza ikusgarriak argitaratu dira azken urte hauetan.
Proteina bakoitzak duen informazio-kodearen barruan bere norabidearen seinalea ere aurki daiteke. Seinale hau proteinaren aurreko muturrean dago eta joan behar duen lekurako ate guztiak irekitzen dizkio. Postaz bidalitako eskutitzaren moduan, zelulak proteina bakoitzaren banaketa-prozesu konplexua bideratuko luke. Azkenean, proteina bere kokalekura iritsi ondoren, norabide-seinalea ezabatu eta beste eremu funtzionaletatik banatzen da kasu batzuetan. Besteetan, proteinaren parte izaten jarraitzen du.
Zenbait animalia itsastarrek berez fluoreszenteak diren proteina batzuk dituzte. Proteina berezi horiek direla eta, marmokak aspalditik dira ezagunak eta, gainera, adierazle fluoreszente gisa ere erabili izan dira beste proteinen norabidea argitzeko.
Teknika ikusgarri honen oinarriak sinpleak dira: ikertu nahi den proteinaren genea aurretik isolatu eta genearen atzean edo erdian adierazle fluoreszentearen genea ipin daiteke; ondoren, berriro zelularen barrura kopia berri bat sartzen da bere bidean jarraitu dezan. Artefakturik gertatzen ez bada, ikertutako proteinak noiz , nora eta zenbat egiten duenari buruzko irudi zehatza eta ikusgarria lor daiteke adierazle fluoreszentearen bidez.
Orain arteko berrikuntzak ikusita, zelula biziak erabilita etorkizunean aurkikuntza asko argitaratuko direla esan daiteke; lortutako emaitzen edertasunak, gainera, jakintzaren plazerra baino askoz gehiago eskainiko digu.
Zu idazle
Zientzia aldizkaria
